Dtor. Salvador Martínez Pérez
Licenciado en Medicina y Cirugía, Doctor en Medicina y Catedrático Universidad.
Ayudantes: Carlos Bueno y Mónica Rodenas
LABORATORIO DE EMBRIOLOGIA EXPERIMENTAL
INSTITUTO DE NEUROCIENCIAS
UNIVERSIDAD MIGUEL HERNANDEZ Y CSIC
PRESUPUESTO: 613.400 EUROS
1. Estudio experimental de la bases moleculares y celulares del fenotipo neural del Síndrome de Maullido de Gato.
El proyecto pretende hacer un estudio del patrón de expresión de los genes situados en el brazo corto del cromosoma (5p). Una vez que se conocen los genes situados en el 5p podría llegarse a identificar cuales de ellos pueden estar más implicados en el desarrollo de las características clínicas del Síndrome de Maullido de Gato (SMG), que es causado por delecciones parciales o totales de esta región.
La variabilidad genética y clínica del SMG ha permitido establecer cierto grado de correlación fenotipo-cariotipo (genetico-clínico), que sugiere que diferentes zonas del 5p causan alteraciones diferentes dentro del síndrome. La localización de genes importantes en el desarrollo del sistema nervioso con su distribución posicional a lo largo del 5p, sugiere que pueden estar implicados en los mecanismos moleculares que determinan el fenotipo cerebral de este sindrome, que en el más importante desde el punto de vista funcional.
Nos proponemos estudiar la expresión de durante el desarrollo neural y embriones de ratón de genes situados en tres regiones del 5p que han sido implicadas en el desarrollo de las alteraciones estructurales cerebrales y la discapacidad mental (Fig. 1):
1.- En la región Terminal del 5p15.3: Genes Iroquois 1, 2 y 4 (Irx1, 2 y 4)
2.- En la región intermedia 5p15.2 (Región crítica SMG): Gen Delta-Catenina (Ctnn)
3.- En la región proximal 5p1514-13: Genes cadherinas 9, 10, 14, 18 (Cdh9,10,14 y18).
1. El patrón de expresión de los genes Irx sugiere su implicación en el atrofia del tronco cerebral. Sabemos la relación regulativa de estos genes con Fgf8. Fgf8 es la molécula morfogenética más importante del tronco cerebral y el cerebelo, así como su papel relevante en el desarrollo del prosencefalo. Nuestro grupo es un grupo reconocido como líder internacional en el estudio del papel de Fgf8 durante el desarrollo neural (ver CV del IP). Así mismo por su expresión en miembros y en su relación con Fgf8 (también muy importante el desarrollo de las extremidades), estos genes pueden estar implicados en las malformaciones asociadas de los miembros que ocurren algunas veces.
2. Delta-catenina se expresa en el encéfalo en desarrollo: en el télencéfalo y el cerebelo de forma predominanate. Junto a este gen se encuentra otro conocido como DAP (death associated protein) que se expresa en tejidos mesenquimales cefálicos y en los cartílagos laríngeos, que podría estar relacionado con el fenotipo facial y el llanto característico de los niños con SMG).
El gen de la semaforia5a se localizaen la región critica de SMG (5p15.2) y su papel en la guía axonal y migración celular sugieren también su implicación en el sindrome.
3. Finalmente las cadherinas se expresan en cerebelo (Cdh9y10) y músculo (Cdh14). La disminución en la función de estos genes puede explicar las alteraciones en el cerebro, sobretodo la atrofia cerebelosa, y en la hipotonía muscular.
Se conoce parcialmente la expresión de estos genes en el desarrollo, así como las alteraciones que su disminución de función producen el desarrollo del cerebro. Nos proponemos inicialmente hacer un estudio preciso de su expresión durante el desarrollo prenatal y postnatal de ratones; para después iniciar un estudio de su función mediante la utilización y el desarrollo de modelos experimentales y animales: explantes cerebrales y ratones trasngénicos. Esto nos permitirá describir modelos animales del SMG, sobre los que se podrán desarrollar mejores diseños experimentales con fines terapéuticos.
Referencias:
Revisión actualizada:
Cerruti Mainardi P. Cri du Chat syndrome. Orphanet J Rare Dis. 2006; Sept. 1:33. Review.
2. Justificación Científica de la Investigación (explicación breve de la necesidad o demanda real que existe para su realización).
La correlación cariotipo-fenotipo es fundamental para poder conocer los mecanismos fisiopatológicos que causan las manifestaciones clínicas del SMG. Puesto que está implicada una región cromósomica precisa (el brazo corto del cromosoma 5) y hay un claro efecto de dosis génica (haploinsificiencia), es muy importante conocer donde se expresan los genes que se situan en el 5p para describir como contribuyen a las alteraciones del síndrome. Hoy en día estamos participando en un estudio de transcritómica a gran escala, donde se estudiara el patrón de expresión de 16.000 genes. Nuestro equipo esta en una posición privilegiada para detectar los genes del 5p que se expresan en las regiones interesantes del sistema nervioso central y en otros órganos corporales. Vamos a aprovechar este estudio para determinar que genes nos interesan y desarrollar trabajos para saber como y cuando se expresan los genes del 5p en el desarrollo del cerebro, fundamentalmente. Después intentaremos, mediante experimentos, determinar como la deficiencia o disminución de función de estos genes altera el desarrollo estructural y funcional del cerebro y, como consecuencia, la discapacidad mental y el retraso psicomotor característicos del SMG. Así mismo analizaremos los efectos pleotrópicos (en múltiples órganos y sistemas) de estos genes, que nos ayuden a conocer mejor como se producen las múltiples anomalías que aparecen a veces en los niños con SMG.
Para llegar a un bien diagnostico genético es fundamental identificar los marcadores adecuados. Del mismo modo la correlación genetico-clínica es fundamental para conocer el origen de los diferentes tipos de manifestaciones (endofenotipos) del SMG, así como su respuesta a la intervención terapéutica y su pronóstico.
3. Finalidad y Objetivos (claros, breves, concretos y realizables).
- Estudiar el patrón de expresión de los genes del 5p: Irx, Catenin, SemaF, Dap y Cdh a lo largo del desarrollo prenatal y postnatal del sistema nervioso.
- Desarrollar estudios experimentales con explantes neuroepiteliales y/o ratones trasngénicos de estos genes.
- Conocer las alteraciones de estos genes en afectados de SMG mediante genética molecular.
- Establcer una relación precisa entre las alterciones genéticas y el fenotipo neural en humanos.
- Crear un banco de DNA y cDNA de los afectados, bajo el patrocinio y dirección de la Fundación Síndrome 5p.
4. Centro / Laboratorio donde se va a llevar a cabo el Proyecto.
LABORATORIO DE EMBRIOLOGIA EXPERIMENTAL
INSTITUTO DE NEUROCIENCIAS
UNIVERSIDAD MIGUEL HERNANDEZ Y CSIC
5. Metodología de la Investigación (sujeto de estudio, diseño, variables, recogida y análisis de datos, dificultades y limitaciones del estudio).
Estudio Experimental:
El sujeto de estudio experimental serán embriones de ratón y ratones postnatales a diferentes estadios del desarrollo. Se manipularán de acuerdo con las normas éticas nacionales e internacionales de experimentación animal.
Los embriones se obtendrán tras anestesia y dislocación cervical de las madres gestantes. El cerebro de los animales postnatales se obtendrá tras anestesia profunda Terminal del animal.
Los tejidos se procesarán para el estudio de expresión de los genes de interés mediante hibridación in situ con sondas de mRNA. Las sondas se obtendran de nuestro estudio transcriptción.
Los estadios del desarrollo a estudiar será: E9.5, 10.5, 11.5, 14.5, 17.5, P0 y P7. Se utilizarán al menos tres muestras para cada determinación, para demostrar la reproductibilidad de los patrones obtenidos.
Los resultados se analizarán bajo microscopia y se fotografiaran para ilustrar los patrones.
Los animales transgénicos se procesarán de la misma manera que los silvestres para el estudio de expresión.
Se realizarán explantes neuroepiteliales para poder estudiar de forma sencilla las posibles interacciones regulativas entre los genes del estudio en las regiones de su expresión, así como con otros genes (Echevarria et al., Int J Dev Biol. Dec; 45 (8):895-902. (2001).
Estudio Genético en efectados:
A través de la Fundación Síndrome 5p se obtendrán datos clínicos y radiológicos de los afectados, así como material para estudio genético: raspado mucosa oral, 2ml de sangre u otro tejido valorable. Las muestras se obtendrán tras la lectura de un consentimiento informado que la asociación hará conocer a los familiares o/y el afectado. De estas muestras se obtendrá el DNA y el CDNA (cuando sea posible) para realizar el estudio de anomalías genéticas del los genes propuestos.
El DNA y cDNA se irá recogiendo y ordenando en un banco genético al servicio de la Fundación Síndrome 5p- y futuros usos científicos.
